作为微生态企业的研发人员，入职第一课是什么？作者认为如果是应届毕业生或者跨行业的新人，入职研发后，一定是首先认识芽孢杆菌，特别是模式种枯草芽孢杆菌。芽孢杆菌怎么会有这种魅力呢？

首先，芽孢杆菌产生休眠孢子，干燥、运输、储藏过程对其影响小，产业化可行性高。

其次，芽孢杆菌进入适宜的环境，萌发后生长繁殖过程分泌多种酶类，促进环境中有机质的分解，是非常优秀的分解者，是水产养殖中水体净化的首选。

再者，芽孢杆菌易培养、易观察，分子生物学鉴定方法完善，应用种类较细化（仅次于乳酸菌），饲料添加剂目录中包含地衣、枯草、迟缓、短小、凝结、侧孢芽孢杆菌和丁酸梭菌，其他常见芽孢杆菌还有简单、蜡样、坚强、贝莱斯、解淀粉、巨大芽孢杆菌等。

下面以常见模式种枯草芽孢杆菌为代表，全方位了解一下芽孢杆菌。

1. 相关国家标准

常用检测方法可参考《GBT 26428-2010 饲用微生物制剂中枯草芽孢杆菌的检测》。

2. 菌落形态

枯草芽孢杆菌菌落表面粗糙，不透明，灰白色或微黄色，用接种环易挑起。



3. 菌体形态
细菌杆状，单生、对生或呈链状。

4. 芽孢形态
芽孢椭圆形，中生或近中生，芽孢囊不明显膨大。



5. 活菌检测

国标方法关键点：培养基采用营养琼脂（NA）培养基、稀释液采用0.85%灭菌生理盐水；合适的梯度进行80℃±1℃水浴处理10min，平板涂布，37℃±1℃培养48h±2h。

根据不同菌株适应生长环境不同，其他可选择的培养基包括LB琼脂等；根据芽孢杆菌营养体的耐热情况不同，其他可选择的水浴处理温度包括75℃±1℃水浴处理20min等，此外对于芽孢成熟度≥99%的产品，为了提高检测效率，可省去水浴一步。根据不同菌株生长速度，我们经常使用的培养时间还有24h±2h。

6. 产酶检测

原理：菌株生长产酶会分解培养基对应的底物，形成透明圈，透明圈越大说明产酶能力越强，透明圈直径/菌落直径的校正圈菌比越大，表示该菌产该酶的能力越大。



(1) 蛋白酶

酪素培养基：干酪素10 g，酵母膏1 g，琼脂20 g，pH 7.0，用蒸馏水定容至1 L，121 ℃灭菌30 min。显色液为酸性汞试剂：HgCl215 g，浓HCl 20 mL，加蒸馏水至100 mL。注意事项：干酪素不好溶解，可加部分NaOH调成碱性，磁力加热搅拌待全溶解后再用稀盐酸调节pH至7.0。

(2) 淀粉酶

淀粉培养基：可溶性淀粉2 g，蛋白胨10 g，牛肉膏5 g，氯化钠5 g，琼脂20 g，pH 7.2，用蒸馏水定容至1 L，121 ℃灭菌30 min。显色液为卢戈氏碘液：碘片1g，碘化钾2g，蒸馏水 300ml（注：先将碘化钾溶解在少量水中，再将碘片溶解在碘化钾中，待碘全溶后，加足水分即可）。注意事项：①可溶性淀粉可先用少量凉水，搅拌后加入沸水中，会溶的比较好；②显色剂颜色消失较快，需尽快测量。

(3) 脂肪酶

脂肪培养基：蛋白胨10g、酵母粉5g、NaCl 10g、三丁酸甘油酯2mL、琼脂粉20g、水1L、pH7.5。脂肪酶解圈可直接观测，无需显色剂。

(4) 纤维素酶

纤维素培养基：羧甲基纤维素钠20g、酵母粉0.5g、磷酸氢二钠2.5g、磷酸二氢钾1.5g、蛋白胨2.5g、琼脂粉20g、水1L、pH7.2。显色液为刚果红染液：刚果红1g、水1L；洗脱液（1mol/L NaCl溶液）：NaCl 58.5g、水1L。在纤维素培养基上滴加刚果红之后用1mol/L NaCl溶液冲洗酶解圈较清晰。

(5) 木聚糖酶

木聚糖培养基：木聚糖10g，蛋白胨5g，NH4NO35g，MgSO4 0.3g，NaCl 5g，K2HPO4 2g，(NH4)2SO4 1g，酵母粉 0.3g，琼脂20g，水1L，pH7.2；显色剂为DNS：参照《GBT 23874-2009 饲料添加剂木聚糖酶活力的测定》中DNS试剂配制方法。

(6) 几丁质酶

几丁质培养基：称取 10 g 几丁质，加入浓 HCl，搅拌成糊状后，放4℃冰箱溶胀，析出沉淀后倒去上清，补充纯水后放置冰箱，重复此操作直至 pH≈7.0。在上述调过pH的几丁质胶体中加入以下物质：K2HPO4 0.7 g，KH2PO4 0.3 g，MgSO4 0.5 g，Fe2(SO4)3 0.01 g，酵母粉0.5 g，琼脂20g，用纯水定容至1 L，调pH至7.0；注意事项：几丁质胶体制备时间较长，需提前1周准备；几丁质酶解圈可直接观测。

7. 分子生物学鉴定

一般采用16S rDNA区段对芽孢杆菌进行菌种鉴定，gyrB基因区段对芽孢杆菌进行亚种鉴定，通过全基因组序列确定具体菌株。


“S2”与相关种的16S rDNA序列系统发育树

“S2”与相关种的gyrB基因序列系统发育树

上标的“T”表示模式菌株。与以NCBI数据库为基源的专业数据库（2020.05.25）进行序列比对。

图文丨梁晶晶

编辑丨孟凡奎

作为微生态企业的研发人员，入职第一课是什么？作者认为如果是应届毕业生或者跨行业的新人，入职研发后，一定是首先认识芽孢杆菌，特别是模式种枯草芽孢杆菌。芽孢杆菌怎么会有这种魅力呢？

首先，芽孢杆菌产生休眠孢子，干燥、运输、储藏过程对其影响小，产业化可行性高。

其次，芽孢杆菌进入适宜的环境，萌发后生长繁殖过程分泌多种酶类，促进环境中有机质的分解，是非常优秀的分解者，是水产养殖中水体净化的首选。

再者，芽孢杆菌易培养、易观察，分子生物学鉴定方法完善，应用种类较细化（仅次于乳酸菌），饲料添加剂目录中包含地衣、枯草、迟缓、短小、凝结、侧孢芽孢杆菌和丁酸梭菌，其他常见芽孢杆菌还有简单、蜡样、坚强、贝莱斯、解淀粉、巨大芽孢杆菌等。

下面以常见模式种枯草芽孢杆菌为代表，全方位了解一下芽孢杆菌。

1. 相关国家标准

常用检测方法可参考《GBT 26428-2010 饲用微生物制剂中枯草芽孢杆菌的检测》。

2. 菌落形态

枯草芽孢杆菌菌落表面粗糙，不透明，灰白色或微黄色，用接种环易挑起。



3. 菌体形态
细菌杆状，单生、对生或呈链状。

4. 芽孢形态
芽孢椭圆形，中生或近中生，芽孢囊不明显膨大。



5. 活菌检测

国标方法关键点：培养基采用营养琼脂（NA）培养基、稀释液采用0.85%灭菌生理盐水；合适的梯度进行80℃±1℃水浴处理10min，平板涂布，37℃±1℃培养48h±2h。

根据不同菌株适应生长环境不同，其他可选择的培养基包括LB琼脂等；根据芽孢杆菌营养体的耐热情况不同，其他可选择的水浴处理温度包括75℃±1℃水浴处理20min等，此外对于芽孢成熟度≥99%的产品，为了提高检测效率，可省去水浴一步。根据不同菌株生长速度，我们经常使用的培养时间还有24h±2h。

6. 产酶检测

原理：菌株生长产酶会分解培养基对应的底物，形成透明圈，透明圈越大说明产酶能力越强，透明圈直径/菌落直径的校正圈菌比越大，表示该菌产该酶的能力越大。



(1) 蛋白酶

酪素培养基：干酪素10 g，酵母膏1 g，琼脂20 g，pH 7.0，用蒸馏水定容至1 L，121 ℃灭菌30 min。显色液为酸性汞试剂：HgCl215 g，浓HCl 20 mL，加蒸馏水至100 mL。注意事项：干酪素不好溶解，可加部分NaOH调成碱性，磁力加热搅拌待全溶解后再用稀盐酸调节pH至7.0。

(2) 淀粉酶

淀粉培养基：可溶性淀粉2 g，蛋白胨10 g，牛肉膏5 g，氯化钠5 g，琼脂20 g，pH 7.2，用蒸馏水定容至1 L，121 ℃灭菌30 min。显色液为卢戈氏碘液：碘片1g，碘化钾2g，蒸馏水 300ml（注：先将碘化钾溶解在少量水中，再将碘片溶解在碘化钾中，待碘全溶后，加足水分即可）。注意事项：①可溶性淀粉可先用少量凉水，搅拌后加入沸水中，会溶的比较好；②显色剂颜色消失较快，需尽快测量。

(3) 脂肪酶

脂肪培养基：蛋白胨10g、酵母粉5g、NaCl 10g、三丁酸甘油酯2mL、琼脂粉20g、水1L、pH7.5。脂肪酶解圈可直接观测，无需显色剂。

(4) 纤维素酶

纤维素培养基：羧甲基纤维素钠20g、酵母粉0.5g、磷酸氢二钠2.5g、磷酸二氢钾1.5g、蛋白胨2.5g、琼脂粉20g、水1L、pH7.2。显色液为刚果红染液：刚果红1g、水1L；洗脱液（1mol/L NaCl溶液）：NaCl 58.5g、水1L。在纤维素培养基上滴加刚果红之后用1mol/L NaCl溶液冲洗酶解圈较清晰。

(5) 木聚糖酶

木聚糖培养基：木聚糖10g，蛋白胨5g，NH4NO35g，MgSO4 0.3g，NaCl 5g，K2HPO4 2g，(NH4)2SO4 1g，酵母粉 0.3g，琼脂20g，水1L，pH7.2；显色剂为DNS：参照《GBT 23874-2009 饲料添加剂木聚糖酶活力的测定》中DNS试剂配制方法。

(6) 几丁质酶

几丁质培养基：称取 10 g 几丁质，加入浓 HCl，搅拌成糊状后，放4℃冰箱溶胀，析出沉淀后倒去上清，补充纯水后放置冰箱，重复此操作直至 pH≈7.0。在上述调过pH的几丁质胶体中加入以下物质：K2HPO4 0.7 g，KH2PO4 0.3 g，MgSO4 0.5 g，Fe2(SO4)3 0.01 g，酵母粉0.5 g，琼脂20g，用纯水定容至1 L，调pH至7.0；注意事项：几丁质胶体制备时间较长，需提前1周准备；几丁质酶解圈可直接观测。

7. 分子生物学鉴定

一般采用16S rDNA区段对芽孢杆菌进行菌种鉴定，gyrB基因区段对芽孢杆菌进行亚种鉴定，通过全基因组序列确定具体菌株。


“S2”与相关种的16S rDNA序列系统发育树

“S2”与相关种的gyrB基因序列系统发育树

上标的“T”表示模式菌株。与以NCBI数据库为基源的专业数据库（2020.05.25）进行序列比对。

图文丨梁晶晶

编辑丨孟凡奎