中国鱼类疫苗技术研发及应用研究进展

王启要

(华东理工大学 生物反应器工程国家重点实验室，上海海洋动物疫苗工程技术研究中心，农业农村部水生动物疫病专业实验室，上海 200237)

摘要:随着水产养殖业高密度、规模化、集约化高速发展，病害已成为产业健康可持续发展的重大挑战。鱼类接种疫苗既可以防控水产病害发生、减少产业的经济损失，又可以减少或消除由于大量使用抗生素带来的健康危害、生态风险和水产品食品安全等问题，从而支撑水产养殖业健康、绿色发展。本文综述了目前国内外鱼类疫苗开发中包括灭活疫苗、减毒/弱毒活疫苗、亚单位/合成肽疫苗和DNA疫苗在内的主要技术策略及相应的接种、递送方式，着重介绍了已经获得中国新兽药证书的9个鱼类疫苗及其应用，以及中国鱼类疫苗审批管理的情况。针对中国高效鱼类疫苗品种供给不足和开发进程漫长等问题，提出了未来应加强鱼类病原与病害相关的基础研究、利用多组学技术推进高效鱼类疫苗的分子设计及构建鱼类疫苗工程研究技术平台等鱼类疫苗工程领域的重点研究方向。

中国水产养殖产量连续30年稳定增长，占据世界总产量的近 70%，近年来渔业产值已超过1.35万亿元[1]，对世界粮食安全做出了重要贡献。随着中国水产养殖业高密度、规模化、集约化高速发展，病害已成为产业健康可持续发展的重大挑战[2]。在过去，人们常用抗生素解决养殖病害问题，不但引发了严重的多耐药病原产生，同时也造成严重的环境危害、健康风险和食品安全问题等。世界海水养殖发达国家和地区在大西洋鲑等养殖产业的成功实践证明，在同各种水产养殖病害的斗争中，基于鱼类免疫系统并以接种疫苗为核心的预防性疫病防控措施是最为突出的贡献[3]。

疫苗是指用各类病原微生物及其成分制作的用于预防接种的一类生物制品。鱼类疫苗是基于鱼类免疫系统开发的用于预防鱼类感染性病害发生的特殊类型疫苗。虽然鱼类的特异性免疫机制还很不完善，但国内外研究证实，鱼类接种疫苗能使鱼体产生免疫保护力。因此，开展鱼类疫苗工程研究意义重大。本文综述了目前国内外鱼类疫苗开发中包括灭活疫苗、减毒/弱毒活疫苗、亚单位疫苗和DNA疫苗在内的主要技术策略及相应的接种、递送方式，着重介绍了已经获得中国新兽药证书的9个鱼类疫苗及其应用，以及中国鱼类疫苗审批管理的情况，并提出了未来中国在鱼类疫苗工程领域的重点研究方向，以期为水产养殖业病害免疫防控体系的构建及产业绿色发展提供科学参考。

1 鱼类疫苗研究与开发概况
1942年，Duff[4]最早研制了杀鲑气单胞菌Aeromonas salmonicida灭活疫苗，发现其对鲑鳟鱼类有较好的免疫作用，由此打开了渔用疫苗开发理论和应用的大门[5-6]。1976年，美国研制的鲑科鱼类肠炎红嘴病(ERM)疫苗获得许可，这是第一种用于水产养殖的商业化疫苗[7-9]。20世纪70年代中期，欧洲和美国等国家和地区的鲑鳟养殖业广泛接种疫苗，用于防治鳗弧菌Vibrio anguillarum、鲁氏耶尔森氏菌Yersinia ruckeri和杀鲑气单胞菌等病原菌造成的病害[6-7]，取得显著效果的同时，抗生素用量极大下降甚至基本停用。此后，各国加大了对渔用疫苗的开发并进入快速发展时期。虽然渔用疫苗适用于鱼类、爬行类和两栖类等水产养殖脊椎动物，但目前主要针对鱼类开展。截至2020年，国外主要由19个跨国公司在全球40多个国家销售26种商业化鱼类疫苗，超过 20多种工业化养殖鱼类有了各自的商业化疫苗，用于免疫防治 20 多种细菌性病害和6 种病毒性病害[6-7]。目前，挪威、美国、加拿大、荷兰、日本和韩国等的渔用疫苗产业化程度较高，市场较成熟。值得关注的是，国际上鱼群疫苗自动注射机的推广应用，日本、韩国渔用疫苗国家补贴政策的大力实施,以及希腊渔用“自家苗”举措的广泛推行等，进一步加快了渔用疫苗在全球养殖业的应用。

中国渔用疫苗的研究起步较晚。1960—1970年代，为预防草鱼Ctenopharyngodon idella出血病，珠江水产研究所与华中农业大学等单位首先研制出鱼组织匀浆灭活疫苗(又称“土法”疫苗)[10]，从而揭开了中国渔用疫苗开发的序幕。草鱼出血病病毒会引起淡水养殖主要品种草鱼发生出血病，死亡率高达90%以上，给水产养殖业造成了巨大损失[11-13]。20世纪80年代，由浙江省淡水水产研究所与中国水产科学研究院长江水产研究所、中国水产科学研究院珠江水产研究所等单位联合攻关，成功建立了草鱼出血病病毒(GCHV)人工敏感细胞系[14]，在此基础上杨先乐等[15]于1984年研制出细胞培养草鱼出血病灭活疫苗，并于1992年获得国家一类新兽药证书，标志着中国渔用疫苗研发与应用进入实质性的产业化阶段。这种疫苗与其他8种获得新兽药证书的疫苗为中国水产病害免疫防治体系的构建打下了坚实基础。2019年初，农业农村部等十部委联合印发了《关于加快推进水产养殖业绿色发展的若干意见》纲领性文件，强调在水产养殖病害防控中，应该以防为主、防治结合，推广接种疫苗等预防技术，推动水产养殖业绿色发展。获得中国新兽药证书的9个鱼类疫苗见表1。

表1 中国已取得注册证书的8个鱼类疫苗(截至2021年底)

Tab.1 Eight licensed fish vaccines in China (by the end of 2021)

2 鱼类疫苗研发的技术策略
鱼类疫苗主要可以分为灭活疫苗、减毒/弱毒活疫苗、亚单位/合成肽疫苗和DNA疫苗等。目前，中国科研人员正在对不同类型的鱼类疫苗进行广泛的基础研究并取得了较好的突破。

2.1 鱼类疫苗的主要类型
1)灭活疫苗。灭活疫苗是指将病原体扩大培养后，通过物理和化学过程使得病原微生物失去了在宿主体内感染或体外复制的能力，而不损害微生物制剂免疫原性的一类疫苗。灭活方法主要利用福尔马林、甲醛、二乙烯亚胺及丙酰内酯等化学物质对病原进行灭活[16]。当然，不同的灭活方法会影响灭活疫苗的免疫原性。与活疫苗相比，灭活疫苗具有安全性高、开发周期短、工艺简单、易于制备多联多价疫苗等优点。灭活疫苗由于不能在体内繁殖，所引起的免疫反应较弱且免疫持续期较短，尤其是不能较好地激活细胞免疫。因此，要获得更好的免疫保护效果，灭活疫苗需要更大的接种剂量，并需要各类佐剂来加强免疫效果。

早期大多数渔用疫苗试验都集中在灭活疫苗上。第一次报道的渔用疫苗是Duff[4]制备的杀鲑气单胞菌灭活疫苗。中国科研人员早期采用草鱼出血病鱼组织匀浆法制备灭活疫苗，后来又研制了具有较高保护力、质量稳定的草鱼出血病细胞培养灭活疫苗[10,13,15]。目前获批的鳜传染性脾肾坏死病灭活疫苗、鰤虹彩病毒灭活疫苗和嗜水气单胞菌败血症灭活疫苗等均采用灭活疫苗的形式。值得注意的是，中国目前已经获得临床批件并正在进行新兽药注册的几种鱼类疫苗，如石斑鱼蛙虹彩病毒病灭活疫苗(HN株)(批件号:2021006)、大菱鲆哈维氏弧菌灭活疫苗(MAVH402株)(2021028)、草鱼嗜水气单胞菌败血症-铜绿假单胞菌赤皮病二联蜂胶灭活疫苗(GA201株+JP802株)(2018008)、大菱鲆鳗弧菌病灭活疫苗(EIBVA1株)(20180026)和石斑鱼哈维氏弧菌病灭活疫苗(VHD株)(20180047)、大菱鲆鳗弧菌灭活疫苗(VAM003株)(2020026)和鲫维氏气单胞菌败血症蜂胶灭活疫苗(AVCA07株)(2022007)等也是基于灭活疫苗的形式。

2)减毒/弱毒活疫苗。减毒/弱毒活疫苗与野生病毒、病原菌相比，其毒力显著减弱，但还保留一定的细胞和宿主侵袭性，能够感染宿主并在宿主体内有限繁殖。相较于灭活疫苗，该类疫苗虽然存在一定的毒力返强风险，但是活疫苗保留了更好的免疫原性，且能够在宿主体内一定限度内繁殖，所以减毒活疫苗能有效激起细胞免疫且免疫持续期较长，呈现较为优良的相对免疫保护率。早期的减毒活疫苗是通过不断传代筛选到减毒株，但这种方法耗时较长，毒力返强可能性较大。目前，对于各类病原都可以通过基因工程技术，删除毒株的毒力和代谢相关基因，从而构建出安全高效的减毒活疫苗株。理性设计这类疫苗需要一定的前期基础研究，必须明确病原致病的相关机制。华东理工大学研究团队研制的大菱鲆迟钝爱德华氏菌活疫苗和大菱鲆鳗弧菌基因工程活疫苗，就是通过大量天然菌株筛选及基因工程技术获得的减毒/弱毒海水鱼类活疫苗。此外，由于该种疫苗能保留较好的宿主侵袭性并能在宿主体内有限繁殖，故减毒/弱毒活疫苗也是优良的载体疫苗出发菌株[17]。

3)亚单位/合成肽疫苗。亚单位/合成肽疫苗是仅仅保留了抗原性成分而制作的疫苗，主要是蛋白质类、多肽类和多糖类物质。由于去除了与免疫保护无关的成分，故亚单位/合成肽疫苗副作用较小，避免了病毒回复突变等危害，取得了较理性的免疫保护效果。亚单位疫苗开发过程中，前期需要大量的基础研究以确定病原的保护性抗原。亚单位/合成肽疫苗可以通过合成肽技术生产，也可以利用DNA重组技术在大肠杆菌和杆状病毒等表达系统中表达，再通过分离纯化来实现。相对来说，亚单位疫苗工艺较复杂且成本较高，而合成肽疫苗工艺较为简单且易于生产。众多的实验室研究发现，亚单位/合成肽疫苗能为各种细菌和病毒性感染提供良好的免疫保护作用。也有研究表明，通过亚单位/合成肽技术获得的多肽能引起相同的免疫反应[3]。目前，鲈鱼弹状病毒基因工程亚单位灭活疫苗(E.coli-G2株)已获得临床试验许可(2021008)。中国尚未见合成肽渔用疫苗的报道。

4)DNA疫苗。DNA疫苗由携带编码病原体抗原基因的重组表达质粒组成，将质粒接种进入鱼体后，可以在宿主细胞中表达抗原，并刺激鱼体产生免疫反应，获得免疫保护效果。实际上，早在20世纪90年代人们就已开始进行鱼类DNA疫苗的研究。如Kanellos等[18]发现，真核表达载体质粒可以在金鱼体内诱导长期外源蛋白表达，同时可以诱导鱼体产生体液和细胞免疫。由于病毒的抗原成分较为简单，所以渔用DNA疫苗研究主要针对鱼类病毒病。水产领域中最早研究的DNA疫苗是抗传染性造血组织坏死病毒(infectious hematopoietic necrosis virus,IHNV)的DNA 疫苗[19]。病毒性出血性败血症病毒(viral haemorrhagic septicaemia virus,VHSV)的表面糖蛋白(蛋白G)包含几个中和表位。将编码糖蛋白的质粒DNA对成年虹鳟Oncorhynchus mykiss进行肌内注射后，质粒 DNA可以持续存在45 d，在肌肉组织提取物中可检测到蛋白G的mRNA，在注射部位的肌肉细胞内还可检测到表达的蛋白G，表明接种DNA疫苗可诱导虹鳟产生高水平的特异性抗VHSV的中和抗体[20]。值得关注的是，中国水产科学研究院黑龙江水产研究所与珠江水产研究所合作开发的虹鳟IHNV核酸疫苗也取得了较好免疫效果，并于2021年获批进入农业部转基因生物安全评价生产性试验阶段。

2.2 鱼类疫苗递送途径
1)注射途径。鱼类疫苗接种主要有注射、浸泡和口服3种途径(表2)。大多数鱼类疫苗是通过腹腔或肌肉注射来实现的，在中国获得批文的9个鱼类疫苗都可以通过注射途径完成接种。传统的灭活疫苗和减毒活疫苗通常都通过腹腔注射来接种，而DNA疫苗等核酸疫苗一般会采用肌肉注射来接种。注射途径有很多优势：接种剂量相对精确且剂量用量小；疫苗在体内存在持续时间长；疫苗在腹腔或肌肉中能较好产生系统性免疫反应，免疫效果好。但注射途径也存在不足：注射会给鱼带来应激反应；注射劳动强度大，费时费力，虽然目前有机械注射装置可以辅助自动注射，但推广程度还不高；注射方法仅适用于体型较大的鱼，并不适用于稚鱼的疫苗接种[21]。

表2 鱼类疫苗3种接种途径的比较

Tab.2 Three administration routes for fish vaccines

2)浸泡途径。对于稚鱼，一般采用浸泡接种途径进行疫苗接种，即将鱼浸泡在疫苗悬液中完成接种过程。疫苗可以通过皮肤和鳃等途径进入待免疫的鱼体，从而激发包括黏膜免疫在内的各种免疫应答[21]。浸泡接种操作方便简单，适合大面积接种疫苗且对鱼产生的应激反应较小。但是浸泡接种也存在劣势，疫苗用量大，只适用于集中鱼群，皮肤屏障也影响疫苗进入鱼体的效率。因此，与注射途径相比，浸泡途径产生的免疫效果较差且每尾鱼的接种量也可能会存在差异。获批的草鱼出血病灭活疫苗和减毒活疫苗、鱼类嗜水气单胞菌败血症灭活疫苗、大菱鲆迟钝爱德华氏菌活疫苗和鳗弧菌基因工程活疫苗也可以采用浸泡的接种方式。值得一提的是，西北农林科技大学联合深圳万可森生物科技有限公司申报的鲈鱼弹状病毒基因工程亚单位灭活疫苗(E.coli-G2株)，就是采用碳纳米管材料促进抗原靶向递送从而开发出的水产浸泡型疫苗。

3)口服途径。口服也常用于鱼类疫苗的接种。肠道黏膜中含有丰富的抗菌肽、补体因子、IgT/M/D免疫球蛋白、cxcd1/scya109等细胞因子和各种抗原递呈细胞及B-/T-细胞等，因此，肠道是鱼类发挥黏膜免疫反应的重要场所[21]。灭活疫苗、减毒活疫苗等经过包封技术处理后，与饲料混合，通过鱼的主动摄食，使得疫苗进入鱼体。口服途径的优势是：操作简单，不需要大量的劳动力；鱼不会产生应激反应；待接种的鱼不受大小限制且适用于分散鱼群。口服途径也有不足：与注射途径相比，口服途径由于只能激发肠道局部黏膜免疫，难以激发系统性的适应性免疫，容易产生免疫耐受等，故免疫效果较差且有效期较短；口服途径疫苗用量大，每尾鱼的疫苗接种量难以精确；有些鱼可能因未摄食饲料导致未接种疫苗等[22]。目前尚没有口服剂型渔用疫苗获得行政批准。

3 中国渔用疫苗审批管理概况
根据中国农业农村部《兽药管理条例》和《兽药注册管理办法》等法规，渔用疫苗在中国属于兽药范畴。因此，渔用疫苗及免疫调节剂、免疫增强剂等相关产品的获批及上市应用，须参照中国对新兽药研发及生产的管理。疫苗要获批上市，需要按照《兽药注册评审工作程序》进行新兽药评审和安全效力复核后，获取新兽药注册证书(进口兽药注册证书)及生产许可证。渔用疫苗等兽药生产企业需要省级兽医行政管理部门审核，获批GMP证书和生产许可证后，才能进行兽药生产。

根据《农业转基因生物安全管理条例》，与农业生产或农产品加工相关的动物、植物、微生物及其产品经基因工程技术而导致基因组构成改变的被认为是农业转基因生物，其中包括了含有转基因微生物或者其产品成分的兽药等产品。因此,基因工程疫苗等新兽药 (灭活疫苗和弱毒活疫苗除外)还需要进行生物安全评价。获得农业转基因生物安全证书才能进入新兽药注册申报。华东理工大学牵头研制的大菱鲆鳗弧菌基因工程活疫苗 (MVAV6203)就属于基因工程新兽药，获得了农业转基因生物安全证书。

另外，中国农业农村部公告第2464号等文件规定，自2018年1月1日起，新兽药注册申请在临床试验方面要严格按照兽药GLP/GCP管理制度等有关规定开展相关工作。其中要求临床试验单位通过GCP的注册，这对渔用疫苗的临床试验和注册申请提出了更高的要求。

4 中国鱼类疫苗研发主要进展
中国目前有9个鱼类疫苗产品获得了国家兽药注册证书，其中5个获得了由政府颁发的兽药生产文号。

4.1 草鱼出血病灭活疫苗和活疫苗
草鱼是中国重要的淡水养殖鱼类，也是中国“四大家鱼”之一，草鱼味道鲜美，具有很高的营养价值，广受人们喜爱。2020年中国草鱼养殖产量超过550万t[1]。根据2020年中国农业农村部水生动物疫病专项监测计划报道，在监测的9种水生动物重点疫病中，阳性样品检出率最高的是草鱼出血病[2]。草鱼出血病是一种病毒性疾病，其病原是草鱼呼肠孤病毒(grass carp reovirus,GCRV)。该病毒是一种双链RNA病毒，其对酸碱的耐受能力较强，可以通过水体或寄生虫传播给健康的草鱼和青鱼等易感鱼类。一般6—10月份是草鱼出血病流行发病期，20～30 ℃水温及养殖密度过高时易发草鱼出血病。草鱼出血病的临床症状主要有：肌肉充血、出血，呈现深红色；肠壁充血，呈现出红肠；红鳍红鳃盖等[11-12]。

早期经过中国多个科研团队的集体攻关，成功研制出草鱼出血病灭活疫苗[13-15]。草鱼出血病灭活疫苗对草鱼出血病具有较好的免疫保护作用，接种该疫苗后鱼体相对存活率可达到(77.1±10.8)%[15]。草鱼出血病灭活疫苗于1992年获得了新药证书((93)新兽药证字14号)，成为中国第一个正式注册获批的鱼类疫苗(表1)。此外，在1994年，中国水产科学研究院珠江水产研究所许淑英等[23]还研制出草鱼出血病活疫苗(GCHV-892)，接种后鱼的相对存活率达到了80%，于2010获得国家一类新兽药证书((2010)新兽药证字51号)。该疫苗分别于2011年和2014年依托中国水产科学院珠江水产研究所和大华农公司获得了兽药生产文号((2011)190986021)和((2014)190026031)。这也是世界上第一个获批并进行产业化应用的针对草鱼出血病的活疫苗。

4.2 嗜水气单胞菌败血症灭活疫苗
2020年中国淡水养殖鱼类产量达2 580万t[1]。然而，淡水鱼养殖过程中却饱受细菌败血症的危害，其主要病原是嗜水气单胞菌Aeromonas hydrophila。嗜水气单胞菌败血症对鲫、鳙等淡水养殖鱼类造成了严重危害[24]。嗜水气单胞菌是一种重要的革兰氏阴性条件致病菌。嗜水气单胞菌的致病性由溶血素、细胞兴奋性肠毒素和胞外酶等多种毒力因子共同组成[25]。1991年，陈怀青等[26]从患病的鲤科鱼类中分离得到嗜水气单胞菌J-1株。针对嗜水气单胞菌J-1株，浙江省淡水水产研究所与南京农业大学合作开发了福尔马林灭活全菌疫苗，并转让给中国水产科学研究院珠江水产研究所获得生产批文。给鲫注射接种该疫苗后，其相对存活率达到75%～85%[27]。2001年该疫苗获得国家一类新兽药证书((2001)新兽药证字06号)，成为中国第一个水产类细菌性疫苗。同时，该种疫苗还可以有效预防鲢、鲫、鳙等其他鱼类嗜水气单胞菌败血症的暴发和流行。该疫苗于2011年获得国内第一个渔用疫苗生产文号((2011)190986013)，标志着中国渔用细菌疫苗走向了产业化应用阶段。

4.3 大菱鲆迟钝爱德华氏菌活疫苗和鳗弧菌基因工程活疫苗
大菱鲆Scophthalmus maximus俗称多宝鱼，于20世纪90年代由雷霁霖等[28]从欧洲引进中国，其主产区在辽宁、天津、河北、山东和江苏等省份。大菱鲆自从欧洲引进以来，因经济价值较高而被广泛养殖，成为中国水产养殖业的一个重要品种。据中国海水鱼产业技术体系年度报告，2019年中国大菱鲆产量总计6.2万t，其中辽宁省占比达到了67.13%[29]。然而高度集约化的生产方式导致大菱鲆产业疾病发生的频率较高，其中由爱德华氏菌属细菌导致的腹水症等病害和鳗弧菌等导致的弧菌病较为普遍，引起大菱鲆大量死亡[30]。在鲆鲽鱼类中致病的爱德华氏菌属细菌主要包括迟缓爱德华氏菌Edwardsiella tarda(也被称为迟钝爱德华氏菌和杀鱼爱德华氏菌)[25]。由于个别养殖户使用抗生素药物等来防治病害，2006、2015年相继受“药残超标”事件的影响，中国大菱鲆养殖业受到较为严重的打击。因此，高效疫苗的开发和应用对大菱鲆养殖业的产业转型升级具有重大意义。

中国学者在国家“863”计划、国家重点研发计划及国家海水鱼产业体系等科研项目的持续资助下，进行了鲆鲽类渔用疫苗的长期攻关工作，并取得了较为重要的突破[31]。华东理工大学张元兴教授团队利用基因工程技术研制了WED减毒活疫苗株，该疫苗去除了多耐药大质粒pEIB202和缺失了aroC和T3SS相关基因eseBCD等。野生型菌株比WED菌株的毒性高5 700倍，说明WED菌株具有显著的减毒效果。同时，WED菌株对大菱鲆具有良好的免疫保护效果，其注射接种和浸泡接种4个月内相对免疫保护率分别为(76.7±3.3)%和(70±0)%[32]。在此基础上，该疫苗于2013年获得中国农业转基因生物安全证书。更为重要的是，基于天然缺失重要毒力因子T3SS和T6SS的菌株EIBAV1，该团队联合广东永顺生物制药有限公司等成功开发了相对免疫保护率达到70%以上的天然弱毒活疫苗(EIBAV1株)[33]。该疫苗于2015年和2016年分别获得国家一类新兽药证书((2015)新兽药证字30号)和兽药生产文号((2016)110576037)，成为中国第一种用于海水养殖动物的活菌疫苗产品。目前，该商品疫苗已在山东、辽宁、河北、天津等多个省份得到规模化推广应用。

在针对鳗弧菌的疫苗开发方面，该团队以野生型鳗弧菌 MVM425 为基础，通过去除毒力相关质粒 pEIB1和缺失了基因组中的aroC基因，构建了基因工程减毒活疫苗菌株 MVAV6203[34]，鱼类通过腹腔注射和浸泡接种后相对免疫保护率达到80%。通过长达10余年的实验室研究、中间试验研究、环境释放和生产性评价等一系列转基因生物安全评价研究，证实该疫苗株保留了鳗弧菌野生出发株原有的免疫原性和侵染能力，并具有良好的生物安全性。该疫苗于2011年获得了中国农业生物转基因安全证书，2019年获批国家一类新兽药证书((2019)新兽药证字15号)，是中国首个渔用基因工程减毒活疫苗。

4.4 牙鲆溶藻弧菌、鳗弧菌和迟缓爱德华氏菌病多联抗独特型抗体疫苗
牙鲆Paralichthys olivaceus是名贵的海产鱼类，其肉嫩、味美，营养价值和经济价值都较高，目前主要在中国北方进行大规模养殖，成为中国重要的海水经济养殖品种。随着养殖规模和密度的扩大，牙鲆的病害发生情况也日益突出，给水产养殖业造成了严重的经济损失。其中由溶藻弧菌、鳗弧菌和迟缓爱德华氏菌等引起的混合、交叉和多重感染性细菌病尤为严重[35-37]。开发多价多联疫苗来应对多种病原菌混合感染具有非常重要的意义。2006年，由北京卓越海洋生物科技有限公司和中国人民解放军第四军医大学共同申报的牙鲆溶藻弧菌、鳗弧菌和迟缓爱德华氏菌病多联抗独特型抗体疫苗获得农业农村部颁发的国家一类新兽药证书((2006)新兽药证字66号)。这是中国首个海水养殖鱼类多联抗独特型抗体疫苗，该疫苗于2017年通过西安斯凯达生物制品有限公司获得兽药生产文号(兽药生字270446033)，并进入产业化应用阶段。

4.5 鳜传染性脾肾坏死病毒灭活疫苗
鱼类虹彩病毒是一类线状双股DNA、由二十面立体对称的衣壳包被并含囊膜的病毒，是目前发现的危害鱼类健康的重要病毒性病原。该科病毒地域分布广泛，可感染近百种淡水、海水鱼类，能导致感染鱼大面积死亡。鳜是一种肉食性淡水经济养殖鱼种，2020年中国鳜产量为37.6万t，较2019年增长11.84%[1]。在长期高密度养殖情况下，病害多发，导致鳜暴发性死亡，其中归类为细胞肿大病毒属的传染性脾肾坏死病毒(infectious spleen and kidney necrosis virus,ISKNV)导致的疾病尤为严重[38]。该病害主要是感染脾脏和肾脏，也感染其他组织和器官。该病毒在发病的时候基本会导致90%以上的鱼死亡，而且发病时间非常短，大概在7～10 d之内就会导致池塘70%～90%的鱼死亡。ISKNV也是淡水鱼和海水鱼病毒性疾病的重要病原，安全高效的疫苗对相关病害防控至关重要。中山大学何建国团队通过十余年的技术攻关，联合广东永顺生物制药有限公司、广东渔跃生物技术有限公司等成功研制出鳜传染性脾肾坏死病灭活疫苗(NH0618株)，相对免疫保护率可达到90%以上[39]。该疫苗于2019年获批国家一类新兽药注册证书((2019)新兽药证字75号)。

4.6 鰤虹彩病毒病灭活疫苗和格式乳球菌病灭活疫苗
虹彩病毒也经常感染海水养殖鱼类。鰤Seriola quinqueradiata又称五条鰤，隶属于鲹科鰤亚科鰤属，是一种温水性深海鱼类。鰤生长速度快，肉质鲜美，在日本已有数十年的养殖历史，已成为日本海水网箱养鱼产量居第一位的重要养殖对象，目前在中国南方开始试养。日本财团法人阪大微生物病研究会将其研制的真鲷/鰤/拟鲹虹彩病毒病灭活疫苗(Ehime-1/GF14株)于2014年在中国成功获批进口注册((2014)外兽药证字48号)，用于真鲷、鰤、拟鲹养殖过程中虹彩病毒病的防治。这是中国第二个进口注册的鱼类疫苗。日本生命科学株式会社于2008年在中国进口注册鰤鱼格式乳球菌病灭活疫苗(BYI株)((2008)外兽药证字16号),用于预防鰤养殖过程中由格式乳球菌病造成的病害。

5 鱼类疫苗研发面临的主要问题和未来重点研究方向
与欧美养殖发达国家大西洋鲑等养殖产业相比，中国水产养殖业中疫苗的普及率无论从覆盖的品种还是单品种的推广程度并不高。其主要问题在于目前获得生产批文的疫苗品种不多、不全，不能完全覆盖主要养殖品种的主要病害，还不足以支撑形成完备的病害免疫综合防控体系。高效疫苗品种供给不足和开发进程漫长也削弱了养殖生产过程中病害免疫防控的总体效果，并降低了养殖户对疫苗产业化应用的信心，对疫苗的推广普及和渔用疫苗产业投入造成一定的负面影响。因此，针对中国渔用疫苗开发的现状，需要加大对鱼类疫苗工程学领域的研究，主要解决以下几个方面的技术挑战，加快推进高效、多联鱼类疫苗开发。

5.1 加强鱼类病原与病害相关基础研究
中国水产养殖地域辽阔，养殖品种繁杂，病害也复杂多变。鱼类是变温动物，复杂的养殖环境造成了病害暴发时多呈现条件致病、多病原感染的特征。基因组测序技术的显著进步，大大促进了鱼类病原的分子分型和系统鉴定，但是需要对病原的血清学和流行规律进行持续系统研究，这也是高效疫苗开发的前提。草鱼出血病减毒活疫苗(GCHV-892株)目前在推广中发现其保护效力变差，可能是因为流行病原发生了显著变异[13]。与国外相比，中国对于鱼类流行病原的血清分型工作基础非常薄弱，无法有力支撑高效疫苗的研究工作。另外，还需要加强对病原条件致病和病害暴发的机制研究。在病害暴发的病原、环境和宿主“三元”系统中，温度、溶氧、盐度、营养盐等环境因子可能是鱼类病害暴发的诱因，深入理解病原菌对相关因子的信号转导机制，可为疫苗的开发和病害的免疫综合控制奠定扎实的理论基础。

5.2 利用多组学技术推进高效鱼类疫苗的分子设计
需要整合最新的各种组学(基因组、功能基因组、蛋白质组和代谢组)技术进行反向疫苗学的研究，促进高效疫苗的分子设计。目前，随着分子生物学技术和基因组编辑技术的飞速发展，反向遗传学和反向疫苗学已经成为人类多种感染性疾病疫苗开发的有力工具，包括系统筛选高效的抗原分子、减毒活疫苗靶点等[7,19]。参考国际上细菌减毒活疫苗开发的成功经验，转座子插入测序(Tn-seq)[40]和CRISPRi-seq[41]等功能基因组学方法的发展，以及在病原感染动态过程中的应用，也可以促进高效疫苗基因靶点的系统筛选，尤其是有助于筛选减毒活疫苗的减毒靶点和安全性靶点。值得注意的是，AlphaFold2等生物信息学工具的革命性突破，能高效准确进行蛋白质结构预测，将极大地促进高效疫苗的分子设计，推进抗原表位的发现和亚单位/载体疫苗的开发等。

DNA疫苗、腺病毒载体疫苗和mRNA疫苗等核酸疫苗开发技术已成为预防病毒感染性疾病的热点技术领域。未来需要采用合成生物学手段突破渔用核酸疫苗的设计和递送等关键技术瓶颈。同时探索核酸疫苗在鱼类变温动物免疫保护中的作用机制和应用潜力，系统研究不同接种/递送途径如何发挥系统性免疫和局部黏膜免疫的协同保护作用等。更为重要的是，采用系统免疫学技术利用单细胞测序平台等从单细胞水平进行疫苗效力的评价，有助于高效疫苗的开发。

5.3 构建鱼类疫苗工程研究技术平台
鱼类疫苗的开发过程显然不是病原分离—灭活—注射的简单技术操作。鱼类疫苗开发是一个复杂的系统工程，需要进一步深入研究鱼类的免疫系统，尤其是鱼类接种后产生免疫反应、免疫记忆、免疫耐受，以及天然免疫、适应性免疫和训练免疫的稳态平衡和转换机制等。同时要加强疫苗接种规程、病害预警、动物模型、疫苗佐剂、免疫增强/调节剂、治疗性疫苗、GMP制造与注册规程、疫苗自动化接种设备和渔用疫苗经济学等方面的系统研究，形成具有中国特色的渔用疫苗工程技术平台和技术联盟，推进中国鱼类多联疫苗的高效开发和应用。尤其是针对重点鱼类养殖品种和主要病害，做到采用疫苗接种进行病害防控全覆盖。

总之，在新冠疫情影响下，“全健康”(one health)理念已深入人心。中国水产养殖业也正在推行“生物安保”理念和措施。目前，中国已经建立了灭活疫苗、减毒活疫苗等成熟的渔用疫苗技术开发路线并成功开发渔用疫苗产品。在此基础上构建以疫苗接种为核心的水产病害免疫综合防控体系，将极大地促进水产养殖业健康绿色高质量发展。

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Fish vaccine technology development and application in China:a review
WANG Qiyao

(State Key Laboratory of Bioreactor Engineering,Aquatic Animal Diseases Research Laboratory,Ministry of Agriculture and Rural Affairs,Shanghai Engineering Research Center of Maricultured Animal Vaccine,East China University of Science and Technology,Shanghai 200237,China)

Abstract：Aquaculture industries have witnessed large-scale,intensive,professional quick development and diseases outbreaks greatly threaten the healthy sustainable development of the industries.Vaccination can not only prevent and control aquatic diseases,reduce the economic loss of aquaculture industry,but also reduce the health hazards and ecological risks brought about by overuse and abuse of antibiotics,which meets the needs of green development of aquaculture industry in China.We reviewed the main stream technologies used for the development,and inoculation strategies and associated delivery methods of vaccines against piscine species,e.g.inactivated vaccines,live attenuated or live avirulent vaccines,subunit vaccines or synthetic peptide vaccine,as well as DNA vaccines.Nine vaccines related to aquatic diseases that have been fully licensed new veterinary drug registration’s certificate in China are described.The overview of administration management of Chinese aquaculture and aquatic vaccines is also introduced in recent years.In addition,the future prospects of development and engineering of piscine vaccines are discussed,including the basic research for fish pathogens and diseases control,molecular design of fish vaccines by leveraging multi-omics technologies,and construction of piscine vaccine engineering and technology platform to facilitate to provide effective vaccines for diseases control in China aquaculture industries.

Key words：vaccine;new veterinary drug;farmed fish;diseases control

中图分类号：S 942

文献标志码：A

DOI：10.16535/j.cnki.dlhyxb.2022-041

文章编号：2095-1388(2022)01-0001-09

收稿日期：2022-02-07

基金项目：国家自然科学基金(32130108,31772891,31772893);财政部和农业农村部：国家现代农业产业技术体系资助(CARS-47)

作者简介：王启要(1978—)，男，博士生导师，教授。E-mail:oaiwqiyao@ecust.edu.cn
关键词:疫苗；新兽药；养殖鱼类；病害防控

中国鱼类疫苗技术研发及应用研究进展

王启要

(华东理工大学 生物反应器工程国家重点实验室，上海海洋动物疫苗工程技术研究中心，农业农村部水生动物疫病专业实验室，上海 200237)

摘要:随着水产养殖业高密度、规模化、集约化高速发展，病害已成为产业健康可持续发展的重大挑战。鱼类接种疫苗既可以防控水产病害发生、减少产业的经济损失，又可以减少或消除由于大量使用抗生素带来的健康危害、生态风险和水产品食品安全等问题，从而支撑水产养殖业健康、绿色发展。本文综述了目前国内外鱼类疫苗开发中包括灭活疫苗、减毒/弱毒活疫苗、亚单位/合成肽疫苗和DNA疫苗在内的主要技术策略及相应的接种、递送方式，着重介绍了已经获得中国新兽药证书的9个鱼类疫苗及其应用，以及中国鱼类疫苗审批管理的情况。针对中国高效鱼类疫苗品种供给不足和开发进程漫长等问题，提出了未来应加强鱼类病原与病害相关的基础研究、利用多组学技术推进高效鱼类疫苗的分子设计及构建鱼类疫苗工程研究技术平台等鱼类疫苗工程领域的重点研究方向。

中国水产养殖产量连续30年稳定增长，占据世界总产量的近 70%，近年来渔业产值已超过1.35万亿元[1]，对世界粮食安全做出了重要贡献。随着中国水产养殖业高密度、规模化、集约化高速发展，病害已成为产业健康可持续发展的重大挑战[2]。在过去，人们常用抗生素解决养殖病害问题，不但引发了严重的多耐药病原产生，同时也造成严重的环境危害、健康风险和食品安全问题等。世界海水养殖发达国家和地区在大西洋鲑等养殖产业的成功实践证明，在同各种水产养殖病害的斗争中，基于鱼类免疫系统并以接种疫苗为核心的预防性疫病防控措施是最为突出的贡献[3]。

疫苗是指用各类病原微生物及其成分制作的用于预防接种的一类生物制品。鱼类疫苗是基于鱼类免疫系统开发的用于预防鱼类感染性病害发生的特殊类型疫苗。虽然鱼类的特异性免疫机制还很不完善，但国内外研究证实，鱼类接种疫苗能使鱼体产生免疫保护力。因此，开展鱼类疫苗工程研究意义重大。本文综述了目前国内外鱼类疫苗开发中包括灭活疫苗、减毒/弱毒活疫苗、亚单位疫苗和DNA疫苗在内的主要技术策略及相应的接种、递送方式，着重介绍了已经获得中国新兽药证书的9个鱼类疫苗及其应用，以及中国鱼类疫苗审批管理的情况，并提出了未来中国在鱼类疫苗工程领域的重点研究方向，以期为水产养殖业病害免疫防控体系的构建及产业绿色发展提供科学参考。

1 鱼类疫苗研究与开发概况
1942年，Duff[4]最早研制了杀鲑气单胞菌Aeromonas salmonicida灭活疫苗，发现其对鲑鳟鱼类有较好的免疫作用，由此打开了渔用疫苗开发理论和应用的大门[5-6]。1976年，美国研制的鲑科鱼类肠炎红嘴病(ERM)疫苗获得许可，这是第一种用于水产养殖的商业化疫苗[7-9]。20世纪70年代中期，欧洲和美国等国家和地区的鲑鳟养殖业广泛接种疫苗，用于防治鳗弧菌Vibrio anguillarum、鲁氏耶尔森氏菌Yersinia ruckeri和杀鲑气单胞菌等病原菌造成的病害[6-7]，取得显著效果的同时，抗生素用量极大下降甚至基本停用。此后，各国加大了对渔用疫苗的开发并进入快速发展时期。虽然渔用疫苗适用于鱼类、爬行类和两栖类等水产养殖脊椎动物，但目前主要针对鱼类开展。截至2020年，国外主要由19个跨国公司在全球40多个国家销售26种商业化鱼类疫苗，超过 20多种工业化养殖鱼类有了各自的商业化疫苗，用于免疫防治 20 多种细菌性病害和6 种病毒性病害[6-7]。目前，挪威、美国、加拿大、荷兰、日本和韩国等的渔用疫苗产业化程度较高，市场较成熟。值得关注的是，国际上鱼群疫苗自动注射机的推广应用，日本、韩国渔用疫苗国家补贴政策的大力实施,以及希腊渔用“自家苗”举措的广泛推行等，进一步加快了渔用疫苗在全球养殖业的应用。

中国渔用疫苗的研究起步较晚。1960—1970年代，为预防草鱼Ctenopharyngodon idella出血病，珠江水产研究所与华中农业大学等单位首先研制出鱼组织匀浆灭活疫苗(又称“土法”疫苗)[10]，从而揭开了中国渔用疫苗开发的序幕。草鱼出血病病毒会引起淡水养殖主要品种草鱼发生出血病，死亡率高达90%以上，给水产养殖业造成了巨大损失[11-13]。20世纪80年代，由浙江省淡水水产研究所与中国水产科学研究院长江水产研究所、中国水产科学研究院珠江水产研究所等单位联合攻关，成功建立了草鱼出血病病毒(GCHV)人工敏感细胞系[14]，在此基础上杨先乐等[15]于1984年研制出细胞培养草鱼出血病灭活疫苗，并于1992年获得国家一类新兽药证书，标志着中国渔用疫苗研发与应用进入实质性的产业化阶段。这种疫苗与其他8种获得新兽药证书的疫苗为中国水产病害免疫防治体系的构建打下了坚实基础。2019年初，农业农村部等十部委联合印发了《关于加快推进水产养殖业绿色发展的若干意见》纲领性文件，强调在水产养殖病害防控中，应该以防为主、防治结合，推广接种疫苗等预防技术，推动水产养殖业绿色发展。获得中国新兽药证书的9个鱼类疫苗见表1。

表1 中国已取得注册证书的8个鱼类疫苗(截至2021年底)

Tab.1 Eight licensed fish vaccines in China (by the end of 2021)

2 鱼类疫苗研发的技术策略
鱼类疫苗主要可以分为灭活疫苗、减毒/弱毒活疫苗、亚单位/合成肽疫苗和DNA疫苗等。目前，中国科研人员正在对不同类型的鱼类疫苗进行广泛的基础研究并取得了较好的突破。

2.1 鱼类疫苗的主要类型
1)灭活疫苗。灭活疫苗是指将病原体扩大培养后，通过物理和化学过程使得病原微生物失去了在宿主体内感染或体外复制的能力，而不损害微生物制剂免疫原性的一类疫苗。灭活方法主要利用福尔马林、甲醛、二乙烯亚胺及丙酰内酯等化学物质对病原进行灭活[16]。当然，不同的灭活方法会影响灭活疫苗的免疫原性。与活疫苗相比，灭活疫苗具有安全性高、开发周期短、工艺简单、易于制备多联多价疫苗等优点。灭活疫苗由于不能在体内繁殖，所引起的免疫反应较弱且免疫持续期较短，尤其是不能较好地激活细胞免疫。因此，要获得更好的免疫保护效果，灭活疫苗需要更大的接种剂量，并需要各类佐剂来加强免疫效果。

早期大多数渔用疫苗试验都集中在灭活疫苗上。第一次报道的渔用疫苗是Duff[4]制备的杀鲑气单胞菌灭活疫苗。中国科研人员早期采用草鱼出血病鱼组织匀浆法制备灭活疫苗，后来又研制了具有较高保护力、质量稳定的草鱼出血病细胞培养灭活疫苗[10,13,15]。目前获批的鳜传染性脾肾坏死病灭活疫苗、鰤虹彩病毒灭活疫苗和嗜水气单胞菌败血症灭活疫苗等均采用灭活疫苗的形式。值得注意的是，中国目前已经获得临床批件并正在进行新兽药注册的几种鱼类疫苗，如石斑鱼蛙虹彩病毒病灭活疫苗(HN株)(批件号:2021006)、大菱鲆哈维氏弧菌灭活疫苗(MAVH402株)(2021028)、草鱼嗜水气单胞菌败血症-铜绿假单胞菌赤皮病二联蜂胶灭活疫苗(GA201株+JP802株)(2018008)、大菱鲆鳗弧菌病灭活疫苗(EIBVA1株)(20180026)和石斑鱼哈维氏弧菌病灭活疫苗(VHD株)(20180047)、大菱鲆鳗弧菌灭活疫苗(VAM003株)(2020026)和鲫维氏气单胞菌败血症蜂胶灭活疫苗(AVCA07株)(2022007)等也是基于灭活疫苗的形式。

2)减毒/弱毒活疫苗。减毒/弱毒活疫苗与野生病毒、病原菌相比，其毒力显著减弱，但还保留一定的细胞和宿主侵袭性，能够感染宿主并在宿主体内有限繁殖。相较于灭活疫苗，该类疫苗虽然存在一定的毒力返强风险，但是活疫苗保留了更好的免疫原性，且能够在宿主体内一定限度内繁殖，所以减毒活疫苗能有效激起细胞免疫且免疫持续期较长，呈现较为优良的相对免疫保护率。早期的减毒活疫苗是通过不断传代筛选到减毒株，但这种方法耗时较长，毒力返强可能性较大。目前，对于各类病原都可以通过基因工程技术，删除毒株的毒力和代谢相关基因，从而构建出安全高效的减毒活疫苗株。理性设计这类疫苗需要一定的前期基础研究，必须明确病原致病的相关机制。华东理工大学研究团队研制的大菱鲆迟钝爱德华氏菌活疫苗和大菱鲆鳗弧菌基因工程活疫苗，就是通过大量天然菌株筛选及基因工程技术获得的减毒/弱毒海水鱼类活疫苗。此外，由于该种疫苗能保留较好的宿主侵袭性并能在宿主体内有限繁殖，故减毒/弱毒活疫苗也是优良的载体疫苗出发菌株[17]。

3)亚单位/合成肽疫苗。亚单位/合成肽疫苗是仅仅保留了抗原性成分而制作的疫苗，主要是蛋白质类、多肽类和多糖类物质。由于去除了与免疫保护无关的成分，故亚单位/合成肽疫苗副作用较小，避免了病毒回复突变等危害，取得了较理性的免疫保护效果。亚单位疫苗开发过程中，前期需要大量的基础研究以确定病原的保护性抗原。亚单位/合成肽疫苗可以通过合成肽技术生产，也可以利用DNA重组技术在大肠杆菌和杆状病毒等表达系统中表达，再通过分离纯化来实现。相对来说，亚单位疫苗工艺较复杂且成本较高，而合成肽疫苗工艺较为简单且易于生产。众多的实验室研究发现，亚单位/合成肽疫苗能为各种细菌和病毒性感染提供良好的免疫保护作用。也有研究表明，通过亚单位/合成肽技术获得的多肽能引起相同的免疫反应[3]。目前，鲈鱼弹状病毒基因工程亚单位灭活疫苗(E.coli-G2株)已获得临床试验许可(2021008)。中国尚未见合成肽渔用疫苗的报道。

4)DNA疫苗。DNA疫苗由携带编码病原体抗原基因的重组表达质粒组成，将质粒接种进入鱼体后，可以在宿主细胞中表达抗原，并刺激鱼体产生免疫反应，获得免疫保护效果。实际上，早在20世纪90年代人们就已开始进行鱼类DNA疫苗的研究。如Kanellos等[18]发现，真核表达载体质粒可以在金鱼体内诱导长期外源蛋白表达，同时可以诱导鱼体产生体液和细胞免疫。由于病毒的抗原成分较为简单，所以渔用DNA疫苗研究主要针对鱼类病毒病。水产领域中最早研究的DNA疫苗是抗传染性造血组织坏死病毒(infectious hematopoietic necrosis virus,IHNV)的DNA 疫苗[19]。病毒性出血性败血症病毒(viral haemorrhagic septicaemia virus,VHSV)的表面糖蛋白(蛋白G)包含几个中和表位。将编码糖蛋白的质粒DNA对成年虹鳟Oncorhynchus mykiss进行肌内注射后，质粒 DNA可以持续存在45 d，在肌肉组织提取物中可检测到蛋白G的mRNA，在注射部位的肌肉细胞内还可检测到表达的蛋白G，表明接种DNA疫苗可诱导虹鳟产生高水平的特异性抗VHSV的中和抗体[20]。值得关注的是，中国水产科学研究院黑龙江水产研究所与珠江水产研究所合作开发的虹鳟IHNV核酸疫苗也取得了较好免疫效果，并于2021年获批进入农业部转基因生物安全评价生产性试验阶段。

2.2 鱼类疫苗递送途径
1)注射途径。鱼类疫苗接种主要有注射、浸泡和口服3种途径(表2)。大多数鱼类疫苗是通过腹腔或肌肉注射来实现的，在中国获得批文的9个鱼类疫苗都可以通过注射途径完成接种。传统的灭活疫苗和减毒活疫苗通常都通过腹腔注射来接种，而DNA疫苗等核酸疫苗一般会采用肌肉注射来接种。注射途径有很多优势：接种剂量相对精确且剂量用量小；疫苗在体内存在持续时间长；疫苗在腹腔或肌肉中能较好产生系统性免疫反应，免疫效果好。但注射途径也存在不足：注射会给鱼带来应激反应；注射劳动强度大，费时费力，虽然目前有机械注射装置可以辅助自动注射，但推广程度还不高；注射方法仅适用于体型较大的鱼，并不适用于稚鱼的疫苗接种[21]。

表2 鱼类疫苗3种接种途径的比较

Tab.2 Three administration routes for fish vaccines

2)浸泡途径。对于稚鱼，一般采用浸泡接种途径进行疫苗接种，即将鱼浸泡在疫苗悬液中完成接种过程。疫苗可以通过皮肤和鳃等途径进入待免疫的鱼体，从而激发包括黏膜免疫在内的各种免疫应答[21]。浸泡接种操作方便简单，适合大面积接种疫苗且对鱼产生的应激反应较小。但是浸泡接种也存在劣势，疫苗用量大，只适用于集中鱼群，皮肤屏障也影响疫苗进入鱼体的效率。因此，与注射途径相比，浸泡途径产生的免疫效果较差且每尾鱼的接种量也可能会存在差异。获批的草鱼出血病灭活疫苗和减毒活疫苗、鱼类嗜水气单胞菌败血症灭活疫苗、大菱鲆迟钝爱德华氏菌活疫苗和鳗弧菌基因工程活疫苗也可以采用浸泡的接种方式。值得一提的是，西北农林科技大学联合深圳万可森生物科技有限公司申报的鲈鱼弹状病毒基因工程亚单位灭活疫苗(E.coli-G2株)，就是采用碳纳米管材料促进抗原靶向递送从而开发出的水产浸泡型疫苗。

3)口服途径。口服也常用于鱼类疫苗的接种。肠道黏膜中含有丰富的抗菌肽、补体因子、IgT/M/D免疫球蛋白、cxcd1/scya109等细胞因子和各种抗原递呈细胞及B-/T-细胞等，因此，肠道是鱼类发挥黏膜免疫反应的重要场所[21]。灭活疫苗、减毒活疫苗等经过包封技术处理后，与饲料混合，通过鱼的主动摄食，使得疫苗进入鱼体。口服途径的优势是：操作简单，不需要大量的劳动力；鱼不会产生应激反应；待接种的鱼不受大小限制且适用于分散鱼群。口服途径也有不足：与注射途径相比，口服途径由于只能激发肠道局部黏膜免疫，难以激发系统性的适应性免疫，容易产生免疫耐受等，故免疫效果较差且有效期较短；口服途径疫苗用量大，每尾鱼的疫苗接种量难以精确；有些鱼可能因未摄食饲料导致未接种疫苗等[22]。目前尚没有口服剂型渔用疫苗获得行政批准。

3 中国渔用疫苗审批管理概况
根据中国农业农村部《兽药管理条例》和《兽药注册管理办法》等法规，渔用疫苗在中国属于兽药范畴。因此，渔用疫苗及免疫调节剂、免疫增强剂等相关产品的获批及上市应用，须参照中国对新兽药研发及生产的管理。疫苗要获批上市，需要按照《兽药注册评审工作程序》进行新兽药评审和安全效力复核后，获取新兽药注册证书(进口兽药注册证书)及生产许可证。渔用疫苗等兽药生产企业需要省级兽医行政管理部门审核，获批GMP证书和生产许可证后，才能进行兽药生产。

根据《农业转基因生物安全管理条例》，与农业生产或农产品加工相关的动物、植物、微生物及其产品经基因工程技术而导致基因组构成改变的被认为是农业转基因生物，其中包括了含有转基因微生物或者其产品成分的兽药等产品。因此,基因工程疫苗等新兽药 (灭活疫苗和弱毒活疫苗除外)还需要进行生物安全评价。获得农业转基因生物安全证书才能进入新兽药注册申报。华东理工大学牵头研制的大菱鲆鳗弧菌基因工程活疫苗 (MVAV6203)就属于基因工程新兽药，获得了农业转基因生物安全证书。

另外，中国农业农村部公告第2464号等文件规定，自2018年1月1日起，新兽药注册申请在临床试验方面要严格按照兽药GLP/GCP管理制度等有关规定开展相关工作。其中要求临床试验单位通过GCP的注册，这对渔用疫苗的临床试验和注册申请提出了更高的要求。

4 中国鱼类疫苗研发主要进展
中国目前有9个鱼类疫苗产品获得了国家兽药注册证书，其中5个获得了由政府颁发的兽药生产文号。

4.1 草鱼出血病灭活疫苗和活疫苗
草鱼是中国重要的淡水养殖鱼类，也是中国“四大家鱼”之一，草鱼味道鲜美，具有很高的营养价值，广受人们喜爱。2020年中国草鱼养殖产量超过550万t[1]。根据2020年中国农业农村部水生动物疫病专项监测计划报道，在监测的9种水生动物重点疫病中，阳性样品检出率最高的是草鱼出血病[2]。草鱼出血病是一种病毒性疾病，其病原是草鱼呼肠孤病毒(grass carp reovirus,GCRV)。该病毒是一种双链RNA病毒，其对酸碱的耐受能力较强，可以通过水体或寄生虫传播给健康的草鱼和青鱼等易感鱼类。一般6—10月份是草鱼出血病流行发病期，20～30 ℃水温及养殖密度过高时易发草鱼出血病。草鱼出血病的临床症状主要有：肌肉充血、出血，呈现深红色；肠壁充血，呈现出红肠；红鳍红鳃盖等[11-12]。

早期经过中国多个科研团队的集体攻关，成功研制出草鱼出血病灭活疫苗[13-15]。草鱼出血病灭活疫苗对草鱼出血病具有较好的免疫保护作用，接种该疫苗后鱼体相对存活率可达到(77.1±10.8)%[15]。草鱼出血病灭活疫苗于1992年获得了新药证书((93)新兽药证字14号)，成为中国第一个正式注册获批的鱼类疫苗(表1)。此外，在1994年，中国水产科学研究院珠江水产研究所许淑英等[23]还研制出草鱼出血病活疫苗(GCHV-892)，接种后鱼的相对存活率达到了80%，于2010获得国家一类新兽药证书((2010)新兽药证字51号)。该疫苗分别于2011年和2014年依托中国水产科学院珠江水产研究所和大华农公司获得了兽药生产文号((2011)190986021)和((2014)190026031)。这也是世界上第一个获批并进行产业化应用的针对草鱼出血病的活疫苗。

4.2 嗜水气单胞菌败血症灭活疫苗
2020年中国淡水养殖鱼类产量达2 580万t[1]。然而，淡水鱼养殖过程中却饱受细菌败血症的危害，其主要病原是嗜水气单胞菌Aeromonas hydrophila。嗜水气单胞菌败血症对鲫、鳙等淡水养殖鱼类造成了严重危害[24]。嗜水气单胞菌是一种重要的革兰氏阴性条件致病菌。嗜水气单胞菌的致病性由溶血素、细胞兴奋性肠毒素和胞外酶等多种毒力因子共同组成[25]。1991年，陈怀青等[26]从患病的鲤科鱼类中分离得到嗜水气单胞菌J-1株。针对嗜水气单胞菌J-1株，浙江省淡水水产研究所与南京农业大学合作开发了福尔马林灭活全菌疫苗，并转让给中国水产科学研究院珠江水产研究所获得生产批文。给鲫注射接种该疫苗后，其相对存活率达到75%～85%[27]。2001年该疫苗获得国家一类新兽药证书((2001)新兽药证字06号)，成为中国第一个水产类细菌性疫苗。同时，该种疫苗还可以有效预防鲢、鲫、鳙等其他鱼类嗜水气单胞菌败血症的暴发和流行。该疫苗于2011年获得国内第一个渔用疫苗生产文号((2011)190986013)，标志着中国渔用细菌疫苗走向了产业化应用阶段。

4.3 大菱鲆迟钝爱德华氏菌活疫苗和鳗弧菌基因工程活疫苗
大菱鲆Scophthalmus maximus俗称多宝鱼，于20世纪90年代由雷霁霖等[28]从欧洲引进中国，其主产区在辽宁、天津、河北、山东和江苏等省份。大菱鲆自从欧洲引进以来，因经济价值较高而被广泛养殖，成为中国水产养殖业的一个重要品种。据中国海水鱼产业技术体系年度报告，2019年中国大菱鲆产量总计6.2万t，其中辽宁省占比达到了67.13%[29]。然而高度集约化的生产方式导致大菱鲆产业疾病发生的频率较高，其中由爱德华氏菌属细菌导致的腹水症等病害和鳗弧菌等导致的弧菌病较为普遍，引起大菱鲆大量死亡[30]。在鲆鲽鱼类中致病的爱德华氏菌属细菌主要包括迟缓爱德华氏菌Edwardsiella tarda(也被称为迟钝爱德华氏菌和杀鱼爱德华氏菌)[25]。由于个别养殖户使用抗生素药物等来防治病害，2006、2015年相继受“药残超标”事件的影响，中国大菱鲆养殖业受到较为严重的打击。因此，高效疫苗的开发和应用对大菱鲆养殖业的产业转型升级具有重大意义。

中国学者在国家“863”计划、国家重点研发计划及国家海水鱼产业体系等科研项目的持续资助下，进行了鲆鲽类渔用疫苗的长期攻关工作，并取得了较为重要的突破[31]。华东理工大学张元兴教授团队利用基因工程技术研制了WED减毒活疫苗株，该疫苗去除了多耐药大质粒pEIB202和缺失了aroC和T3SS相关基因eseBCD等。野生型菌株比WED菌株的毒性高5 700倍，说明WED菌株具有显著的减毒效果。同时，WED菌株对大菱鲆具有良好的免疫保护效果，其注射接种和浸泡接种4个月内相对免疫保护率分别为(76.7±3.3)%和(70±0)%[32]。在此基础上，该疫苗于2013年获得中国农业转基因生物安全证书。更为重要的是，基于天然缺失重要毒力因子T3SS和T6SS的菌株EIBAV1，该团队联合广东永顺生物制药有限公司等成功开发了相对免疫保护率达到70%以上的天然弱毒活疫苗(EIBAV1株)[33]。该疫苗于2015年和2016年分别获得国家一类新兽药证书((2015)新兽药证字30号)和兽药生产文号((2016)110576037)，成为中国第一种用于海水养殖动物的活菌疫苗产品。目前，该商品疫苗已在山东、辽宁、河北、天津等多个省份得到规模化推广应用。

在针对鳗弧菌的疫苗开发方面，该团队以野生型鳗弧菌 MVM425 为基础，通过去除毒力相关质粒 pEIB1和缺失了基因组中的aroC基因，构建了基因工程减毒活疫苗菌株 MVAV6203[34]，鱼类通过腹腔注射和浸泡接种后相对免疫保护率达到80%。通过长达10余年的实验室研究、中间试验研究、环境释放和生产性评价等一系列转基因生物安全评价研究，证实该疫苗株保留了鳗弧菌野生出发株原有的免疫原性和侵染能力，并具有良好的生物安全性。该疫苗于2011年获得了中国农业生物转基因安全证书，2019年获批国家一类新兽药证书((2019)新兽药证字15号)，是中国首个渔用基因工程减毒活疫苗。

4.4 牙鲆溶藻弧菌、鳗弧菌和迟缓爱德华氏菌病多联抗独特型抗体疫苗
牙鲆Paralichthys olivaceus是名贵的海产鱼类，其肉嫩、味美，营养价值和经济价值都较高，目前主要在中国北方进行大规模养殖，成为中国重要的海水经济养殖品种。随着养殖规模和密度的扩大，牙鲆的病害发生情况也日益突出，给水产养殖业造成了严重的经济损失。其中由溶藻弧菌、鳗弧菌和迟缓爱德华氏菌等引起的混合、交叉和多重感染性细菌病尤为严重[35-37]。开发多价多联疫苗来应对多种病原菌混合感染具有非常重要的意义。2006年，由北京卓越海洋生物科技有限公司和中国人民解放军第四军医大学共同申报的牙鲆溶藻弧菌、鳗弧菌和迟缓爱德华氏菌病多联抗独特型抗体疫苗获得农业农村部颁发的国家一类新兽药证书((2006)新兽药证字66号)。这是中国首个海水养殖鱼类多联抗独特型抗体疫苗，该疫苗于2017年通过西安斯凯达生物制品有限公司获得兽药生产文号(兽药生字270446033)，并进入产业化应用阶段。

4.5 鳜传染性脾肾坏死病毒灭活疫苗
鱼类虹彩病毒是一类线状双股DNA、由二十面立体对称的衣壳包被并含囊膜的病毒，是目前发现的危害鱼类健康的重要病毒性病原。该科病毒地域分布广泛，可感染近百种淡水、海水鱼类，能导致感染鱼大面积死亡。鳜是一种肉食性淡水经济养殖鱼种，2020年中国鳜产量为37.6万t，较2019年增长11.84%[1]。在长期高密度养殖情况下，病害多发，导致鳜暴发性死亡，其中归类为细胞肿大病毒属的传染性脾肾坏死病毒(infectious spleen and kidney necrosis virus,ISKNV)导致的疾病尤为严重[38]。该病害主要是感染脾脏和肾脏，也感染其他组织和器官。该病毒在发病的时候基本会导致90%以上的鱼死亡，而且发病时间非常短，大概在7～10 d之内就会导致池塘70%～90%的鱼死亡。ISKNV也是淡水鱼和海水鱼病毒性疾病的重要病原，安全高效的疫苗对相关病害防控至关重要。中山大学何建国团队通过十余年的技术攻关，联合广东永顺生物制药有限公司、广东渔跃生物技术有限公司等成功研制出鳜传染性脾肾坏死病灭活疫苗(NH0618株)，相对免疫保护率可达到90%以上[39]。该疫苗于2019年获批国家一类新兽药注册证书((2019)新兽药证字75号)。

4.6 鰤虹彩病毒病灭活疫苗和格式乳球菌病灭活疫苗
虹彩病毒也经常感染海水养殖鱼类。鰤Seriola quinqueradiata又称五条鰤，隶属于鲹科鰤亚科鰤属，是一种温水性深海鱼类。鰤生长速度快，肉质鲜美，在日本已有数十年的养殖历史，已成为日本海水网箱养鱼产量居第一位的重要养殖对象，目前在中国南方开始试养。日本财团法人阪大微生物病研究会将其研制的真鲷/鰤/拟鲹虹彩病毒病灭活疫苗(Ehime-1/GF14株)于2014年在中国成功获批进口注册((2014)外兽药证字48号)，用于真鲷、鰤、拟鲹养殖过程中虹彩病毒病的防治。这是中国第二个进口注册的鱼类疫苗。日本生命科学株式会社于2008年在中国进口注册鰤鱼格式乳球菌病灭活疫苗(BYI株)((2008)外兽药证字16号),用于预防鰤养殖过程中由格式乳球菌病造成的病害。

5 鱼类疫苗研发面临的主要问题和未来重点研究方向
与欧美养殖发达国家大西洋鲑等养殖产业相比，中国水产养殖业中疫苗的普及率无论从覆盖的品种还是单品种的推广程度并不高。其主要问题在于目前获得生产批文的疫苗品种不多、不全，不能完全覆盖主要养殖品种的主要病害，还不足以支撑形成完备的病害免疫综合防控体系。高效疫苗品种供给不足和开发进程漫长也削弱了养殖生产过程中病害免疫防控的总体效果，并降低了养殖户对疫苗产业化应用的信心，对疫苗的推广普及和渔用疫苗产业投入造成一定的负面影响。因此，针对中国渔用疫苗开发的现状，需要加大对鱼类疫苗工程学领域的研究，主要解决以下几个方面的技术挑战，加快推进高效、多联鱼类疫苗开发。

5.1 加强鱼类病原与病害相关基础研究
中国水产养殖地域辽阔，养殖品种繁杂，病害也复杂多变。鱼类是变温动物，复杂的养殖环境造成了病害暴发时多呈现条件致病、多病原感染的特征。基因组测序技术的显著进步，大大促进了鱼类病原的分子分型和系统鉴定，但是需要对病原的血清学和流行规律进行持续系统研究，这也是高效疫苗开发的前提。草鱼出血病减毒活疫苗(GCHV-892株)目前在推广中发现其保护效力变差，可能是因为流行病原发生了显著变异[13]。与国外相比，中国对于鱼类流行病原的血清分型工作基础非常薄弱，无法有力支撑高效疫苗的研究工作。另外，还需要加强对病原条件致病和病害暴发的机制研究。在病害暴发的病原、环境和宿主“三元”系统中，温度、溶氧、盐度、营养盐等环境因子可能是鱼类病害暴发的诱因，深入理解病原菌对相关因子的信号转导机制，可为疫苗的开发和病害的免疫综合控制奠定扎实的理论基础。

5.2 利用多组学技术推进高效鱼类疫苗的分子设计
需要整合最新的各种组学(基因组、功能基因组、蛋白质组和代谢组)技术进行反向疫苗学的研究，促进高效疫苗的分子设计。目前，随着分子生物学技术和基因组编辑技术的飞速发展，反向遗传学和反向疫苗学已经成为人类多种感染性疾病疫苗开发的有力工具，包括系统筛选高效的抗原分子、减毒活疫苗靶点等[7,19]。参考国际上细菌减毒活疫苗开发的成功经验，转座子插入测序(Tn-seq)[40]和CRISPRi-seq[41]等功能基因组学方法的发展，以及在病原感染动态过程中的应用，也可以促进高效疫苗基因靶点的系统筛选，尤其是有助于筛选减毒活疫苗的减毒靶点和安全性靶点。值得注意的是，AlphaFold2等生物信息学工具的革命性突破，能高效准确进行蛋白质结构预测，将极大地促进高效疫苗的分子设计，推进抗原表位的发现和亚单位/载体疫苗的开发等。

DNA疫苗、腺病毒载体疫苗和mRNA疫苗等核酸疫苗开发技术已成为预防病毒感染性疾病的热点技术领域。未来需要采用合成生物学手段突破渔用核酸疫苗的设计和递送等关键技术瓶颈。同时探索核酸疫苗在鱼类变温动物免疫保护中的作用机制和应用潜力，系统研究不同接种/递送途径如何发挥系统性免疫和局部黏膜免疫的协同保护作用等。更为重要的是，采用系统免疫学技术利用单细胞测序平台等从单细胞水平进行疫苗效力的评价，有助于高效疫苗的开发。

5.3 构建鱼类疫苗工程研究技术平台
鱼类疫苗的开发过程显然不是病原分离—灭活—注射的简单技术操作。鱼类疫苗开发是一个复杂的系统工程，需要进一步深入研究鱼类的免疫系统，尤其是鱼类接种后产生免疫反应、免疫记忆、免疫耐受，以及天然免疫、适应性免疫和训练免疫的稳态平衡和转换机制等。同时要加强疫苗接种规程、病害预警、动物模型、疫苗佐剂、免疫增强/调节剂、治疗性疫苗、GMP制造与注册规程、疫苗自动化接种设备和渔用疫苗经济学等方面的系统研究，形成具有中国特色的渔用疫苗工程技术平台和技术联盟，推进中国鱼类多联疫苗的高效开发和应用。尤其是针对重点鱼类养殖品种和主要病害，做到采用疫苗接种进行病害防控全覆盖。

总之，在新冠疫情影响下，“全健康”(one health)理念已深入人心。中国水产养殖业也正在推行“生物安保”理念和措施。目前，中国已经建立了灭活疫苗、减毒活疫苗等成熟的渔用疫苗技术开发路线并成功开发渔用疫苗产品。在此基础上构建以疫苗接种为核心的水产病害免疫综合防控体系，将极大地促进水产养殖业健康绿色高质量发展。

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Fish vaccine technology development and application in China:a review
WANG Qiyao

(State Key Laboratory of Bioreactor Engineering,Aquatic Animal Diseases Research Laboratory,Ministry of Agriculture and Rural Affairs,Shanghai Engineering Research Center of Maricultured Animal Vaccine,East China University of Science and Technology,Shanghai 200237,China)

Abstract：Aquaculture industries have witnessed large-scale,intensive,professional quick development and diseases outbreaks greatly threaten the healthy sustainable development of the industries.Vaccination can not only prevent and control aquatic diseases,reduce the economic loss of aquaculture industry,but also reduce the health hazards and ecological risks brought about by overuse and abuse of antibiotics,which meets the needs of green development of aquaculture industry in China.We reviewed the main stream technologies used for the development,and inoculation strategies and associated delivery methods of vaccines against piscine species,e.g.inactivated vaccines,live attenuated or live avirulent vaccines,subunit vaccines or synthetic peptide vaccine,as well as DNA vaccines.Nine vaccines related to aquatic diseases that have been fully licensed new veterinary drug registration’s certificate in China are described.The overview of administration management of Chinese aquaculture and aquatic vaccines is also introduced in recent years.In addition,the future prospects of development and engineering of piscine vaccines are discussed,including the basic research for fish pathogens and diseases control,molecular design of fish vaccines by leveraging multi-omics technologies,and construction of piscine vaccine engineering and technology platform to facilitate to provide effective vaccines for diseases control in China aquaculture industries.

Key words：vaccine;new veterinary drug;farmed fish;diseases control

中图分类号：S 942

文献标志码：A

DOI：10.16535/j.cnki.dlhyxb.2022-041

文章编号：2095-1388(2022)01-0001-09

收稿日期：2022-02-07

基金项目：国家自然科学基金(32130108,31772891,31772893);财政部和农业农村部：国家现代农业产业技术体系资助(CARS-47)

作者简介：王启要(1978—)，男，博士生导师，教授。E-mail:oaiwqiyao@ecust.edu.cn
关键词:疫苗；新兽药；养殖鱼类；病害防控