海水鱼类刺激隐核虫病检疫操作
https://v.douyin.com/MpucAnn 刺激隐核虫病的病原为刺激隐核虫，其生活史分为4个阶段，即滋养体(trophont)、包囊前体 (protomont)、包囊体 (tomont)和幼虫 (theront) 阶段。寄生在鱼体上的阶段称为滋养体，呈圆形或梨形，能在上皮浅表层内旋转运动，以宿主的体液、组织细胞为食; 成熟后脱离宿主进入水体，即成为自由活动的包囊前体，此期虫体可在水体中自由游动(为2～8 h); 然后附着在固着物上，形成包囊，包囊在适合的环境条件下，其内部的原生质细胞经历一系列不均等分裂形成幼体; 幼体成熟后逸出包囊进入水中，成为具有感染能力的幼虫。 刺激隐核虫病可以危害绝大多数海水硬骨鱼类。 迄今为止，报道刺激隐核虫病的地区包括印度洋、太平洋、波斯湾、以色列红海、大西洋和加勒比海等热带、亚热带海区。在东南亚海区，刺激隐核虫病发病严重的鱼类主要为网箱养殖的卵形鲳鲹、大黄鱼、石斑鱼、鲈鱼、鲷科鱼类和比目鱼类等，一般认为发病与放养密度过大密切相关。刺激隐核虫病主要发病季节为5月下旬至7月中旬、9月中旬至次年1月下旬水温22～30℃的季节，水温25～28℃是发病流行高峰期。病鱼表现为摄食量减少，身体消瘦，游动缓慢，呈分散状态、离群漫游，翻转身体，呼吸频率加快，严重时导致死亡。
(一)临床检查 1. 群体检查 主要检查待检批次海水鱼苗种的游动状态、摄食情况是否正常。群体活力旺盛，逃避反应明显，体色、体态及外观正常，摄食正常，则在群体中按采样规范采集不少于150尾鱼苗 (种)进行个体检查和试剂盒检查。 鱼群中若有出现摄食量减少，甚至停止进食，以及蹭擦池底或池壁现象的个体，采集症状明显的个体不少于10尾，逐尾检查。 2. 个体检查 (1)外观检查。 主要检查鱼体表和鳃上是否有大量的小白点及黏液。若肉眼见体表和鳃上呈现许多针头大小的小白点 (俗称 “白点病”)，鳃丝苍白，皮肤因虫体寄生、擦伤而呈出血、溃疡和糜烂，造成鳍条缺损、开叉，甚至出现烂鳍、烂尾、眼角膜浑浊发白、瞎眼等症状 (图8-26、图8-27)，怀疑患海水鱼类刺激隐核虫病。图8-26 感染刺激隐核虫的卵形鲳鲹体表症状图8-27 感染刺激隐核虫的卵形鲳鲹鳃的外观症状 (2)显微镜检查。 通过鳃丝或黏液压片观察是否存在黑色圆形或椭圆形周身纤毛的虫体，若观察到该形态虫体，怀疑感染海水鱼类刺激隐核虫。 具体操作方法如下： 鳃丝压片： 取鳃丝压片 (具体操作方法参照“第四章 镜检操作 一、鱼类寄生虫制片镜检”部分)，显微镜下观察鳃丝上皮浅层下是否具有向外凸出的包囊，该包囊内含黑色圆形或椭圆形滋养体，滋养体周身纤毛，活体可持续旋转运动。
黏液压片： 用载玻片将鱼体表或鳍条上黏液轻轻刮下压片 (具体操作方法参照“第四章 镜检操作 一、鱼类寄生虫制片镜检”部分)，显微镜下观察黏液中是否有黑色圆形或椭圆形虫体，该虫体周身纤毛，活体可运动，大小为0.2～0.5 mm (图8-28)。图8-28 显微镜下刺激隐核虫虫体形态
3. 快速检测试剂盒检测 按照病原快速检测试剂盒说明书进行采样和现场快速检测，样品出现试剂盒所指示的阳性反应，怀疑存在海水鱼类刺激隐核虫。
(二)实验室检查 对怀疑患有海水鱼类刺激隐核虫病及临床检查发现具有刺激隐核虫病相关临床症状的苗种，应按 《水生动物产地检疫采样技术规范》(SC/T 7103—2008) 的要求对该批次苗种采样送实验室检测。
1. 采样 按SC/T 7103—2008的规定执行。 2. 特异性基因检测 (1)用载玻片将鱼鳃或体表上虫体轻轻刮下 (图8-29、图8-30)。 (2)用吸管或移液器吸取1个或几个虫体于干净平皿中，用灭菌水反复洗涤3次 (图8-31、图8-32)。图8-29 将鱼鳃上虫体轻轻刮下图8-30 将鱼体表上虫体轻轻刮下图8-31 吸管吸取虫体于干净平皿
图8-32 灭菌水反复洗涤3次 (3)再转移到洁净的离心管中，用研磨棒磨碎，使其充分破裂 (图8-33)。 (4)加入蛋白酶K(终浓度为200 μg/mL)消化，按微量样品基因组DNA抽提试剂盒说明书的方法提取DNA，将提取的DNA用双蒸水稀释至总体积40μL，4℃保存待用。 (5)分别以引物对P1/P2和P1/P3进行一次和二次PCR扩增 (P1： 5′-GTT CCC CTT GAA CGAGGA ATT C-3′，P2： 5′-TTA GTT TCT TTT CCTCCG CT-3 ′，P3： 5′-TGA GAG AAT TAA TCATAA TTT ATA-3′)，以一次PCR扩增产物稀释100倍为模板进行二次PCR扩增，一次和二次扩增PCR反应程序为： 95℃ 5 min (预变性);95℃ 20 s (变性)，55℃ 20 s (退火)，72℃ 1 min (延伸)，35个循环; 72℃ 10 min (延伸)。二次PCR扩增完后进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图8-34所示。图8-33 研磨棒磨碎3. 结果判定 如果在体表或鳃上观察到虫体，或用PCR方法扩增出540 bp的DNA带，苗种同时表现出刺激隐核虫感染临床症状，则判定该批次海水鱼苗种患刺激隐核虫病。
图8-34 刺激隐核虫特异性PCR扩增结果 M. DL2000 Marker; 1. 阳性对照; 2. 阴性对照; 3. 空白对照; 4. 刺激隐核虫检测样品第一次PCR产 物; 5. 刺激隐核虫检测样品第二次PCR产物
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